為了定量地表達受納水體的污染負荷與生物學效應之間的關系,可以在適當控制的條件下,把受試魚類放入含不同濃度的已知或未知毒物的水體中,觀察和記錄魚類的各種反應,這就是魚類毒性試驗。由于魚類對水環境的變化反應十分敏感,當水體中的污染物達到一定強度時,就會引起一系列中毒反應,如行為異常、生理功能紊亂、組織細胞病變直至死亡。因此,魚類毒性試驗常用作檢測水體污染的有效方法。

(1)試驗魚的選擇和馴養? 在選擇試驗魚的種類時,一般考慮魚的下述性狀和特點:敏感度高,代表性強,取材方便,大小適中,在室內條件下易于飼養和繁殖。實驗用魚必須健康無病、行動活潑,其外觀體色發亮、魚鰭完整舒展,逆水性強,食欲強。魚的大小和品種都可能導致對毒物敏感度不同,因此在同一試驗中,要求試驗魚必須同種、同齡、同一來源。個體應盡可能大小一致,個體以長不超過5~8cm為宜,最大個體不可大于最小個體的50%。

試驗魚必須經過馴養。馴養的目的是使魚類適應實驗室的生活環境,并對試驗魚進行健康選擇。馴養時間為7~15d。馴養用水(水溫、水質等)必須與試驗用水一致。馴養期間,魚的死亡率不得大于5%,否則該批魚不得用于試驗。此外,正式試驗的前一天應停止喂食,因為喂食會增加魚的呼吸代謝和排泄物,影響試驗液的毒性。

(2)實驗準備? 每個試驗濃度為一組,每組至少10尾魚。為便于觀察,容器采用玻璃缸,每升水中魚重不超過2g。

①試驗液中的溶解氧。溶解氧是魚類生存的必要條件。對于溫水性魚類試驗溶解氧含量不得低于4mg/L;對于冷水性魚類,不得低于5mg/L。如果受試物質本身耗氧量大,則應采取措施補充水中的溶解氧,可采取更換試驗液或有控制地對試驗液充氧,使試驗在氧充足的條件下進行。

②試驗液的溫度。試驗期間應保持魚類原來的適應溫度。一般來說,溫水性魚類要求水溫在20~28℃,冷水性魚類要求水溫在12~18℃。

水溫對受試物質的毒性有一定的影響,一般溫度高時毒性大。因此,為了使試驗結果可靠,在同一試驗中,溫度的波動為±2℃。對于比較嚴格的試驗,推薦(25±1)℃作為溫水性魚類的標準水溫,(15±1)℃作為冷水性魚類的標準水溫。

③試驗液的pH值。試驗液的pH值與生物的代謝有密切關系;另一方面,pH值可能影響某些毒物的離子化,也可能影響其溶解度此外,pH值對氨和氰化物的影響特別明顯。所以在毒性試驗中,應維持pH值在魚類的適應范圍之內,即pH=6.5~8.5,試驗期間,pH值的波動范圍不得超過0.4個pH值單位。

④試驗液的硬度。一般來說,硬水可降低毒物毒性,而軟水可增強毒性。因此,必須注意檢測試驗液的硬度值,并在報告中注明。硬度在(以CaCO3計)50~250mg/L之間均可。如果硬度過大,可用配比法適當調整。

(3)試驗步驟

①預備試驗。為保證正式試驗順利進行,必須先進行探索性預備試驗,以觀察試驗魚的中毒表現和選擇觀察指標,確定正式試驗的大致濃度范圍,檢驗規定的試驗條件是否合適。該試驗的濃度范圍可適當大些每組魚的尾數是3~5個,觀察24~48h內魚類中毒反應和死亡情況,從最高全存活濃度和最低全死亡濃度之間選擇下一步正式試驗的濃度范圍。

②正式試驗濃度設計和毒性判斷。合理設計試驗濃度,對試驗的成功和精確有很大影響。在試驗中通常要選7個濃度(至少5個),濃度間取等對數間距,它既可代表體積分數比,也可代表mg/L或μg/L。例如,10.0、5.6、3.2、1.8、1.0(對數間距0.25)或10.0、7.9、6.3、5.0、4.0、3.6、2.5、2.0、1.6、1.26、1.0(對數間距0.1)。另設一對照組,對照組在試驗期間魚死亡率不得超過10%,否則整個試驗結果就不能采用。

試驗開始的前8個小時應連續觀察和記錄,如果正常,則繼續試驗,做第24h、48h和96h的觀察記錄。試驗過程發現特異變化應隨時記錄,根據魚的死亡情況、中毒癥狀判斷毒物或工業廢水毒性大小。如毒物的飽和溶液或所試工業廢水在96h內不引起試驗魚的死亡時,可以認為毒性不顯著。

魚類毒性試驗的半致死濃度LC50是反映毒物或工業廢水對魚類生存影響的重要指標。LC50的計算常用直線內插法,即在半對數方格紙上,以對數坐標軸表示濃度,以算術坐標軸表示死亡率,然后將試驗數據一一標在方格紙上選取最接近于半數死亡率的兩點,即大于50%死亡率的一點和小于50%死亡率的一點,用直線連接。直線與50%死亡直線相交,再從交點引一垂線至濃度坐標軸,即為LC50。

此法簡單快速,但無法求出95%可信限。

表所列數據為假定的試驗資料,根據表中試驗結果,得出24h的LC50為5.2%,48h的LC50為4.7%和96h的LC50為4.4%。

③魚類毒性試驗結果的應用。魚類毒性試驗的一個重要目的是根據試驗數據估算毒物的安全濃度,估算安全濃度的經驗公式有如下幾種:

目前應用比較普遍的是最后一種。對那些易分解、積累少的化學物質一般選用0.050.1之間的系數,而對于穩定的又能在魚體內高蓄積的化學物質,系數都在0.01~0.05范圍內選擇。

一應用LC50值推導出安全濃度后,最好再進一步進行驗證試驗,特別是具有揮發性和不穩定性的毒物或廢水,應當用恒流裝置進行長時間的驗證試驗,96h內不發生死亡或中毒的濃度往往不能代表魚類長期生活在被污染水體的安全或無毒濃度。

驗證試驗一般用10條魚以上,在較大容器中用預想安全濃度進行一個月或幾個月的試驗,并設對照組進行比較。如有中毒癥狀發生則降低濃度再試驗,直到確證某濃度對魚是安全的,即可定為安全濃度。此外,驗證試驗過程中必須投喂餌料。