枝角類(lèi)毒性試驗(yàn)方法介紹
枝角類(lèi)(Cladocera)通稱(chēng)溞類(lèi),俗稱(chēng)紅蟲(chóng)或魚(yú)蟲(chóng),它是一類(lèi)與昆蟲(chóng)近親的小型甲殼動(dòng)物,廣泛分布于自然水體中,是魚(yú)類(lèi)的天然餌料。枝角類(lèi)繁殖力強(qiáng),生活周期短,容易培養(yǎng),因此也是一類(lèi)很好的試驗(yàn)動(dòng)物。溞類(lèi)對(duì)許多毒物(特別是重金屬和有機(jī)磷農(nóng)藥)比其他水生動(dòng)物要敏感。當(dāng)含有農(nóng)藥等有毒廢水排入水體時(shí),往往先引起類(lèi)的死亡,破壞水生生態(tài)系統(tǒng)的平衡,從而影響?hù)~(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)。因此在制定漁業(yè)水體水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)和工業(yè)廢水排放標(biāo)準(zhǔn)時(shí),常配合魚(yú)類(lèi)毒性試驗(yàn)而被廣泛采用。
(1)試驗(yàn)類(lèi)及其選擇用來(lái)進(jìn)行毒性試驗(yàn)的溞應(yīng)具有一定的代表性,對(duì)毒性要比較敏感,而且應(yīng)來(lái)源豐富。我國(guó)有溞130多種,試驗(yàn)常用的有大型溞、溞狀溞、隆線溞和多刺裸腹溞等,前三種都比較大,試驗(yàn)更為方便。
溞類(lèi)的生殖方式有兩種,即孤雌生殖和有性生殖。孤雌生殖產(chǎn)卵很多,不需要受精就能發(fā)育成個(gè)體(大多是雌體),到秋末冬初或遇到環(huán)境不良時(shí),才能有雄體產(chǎn)生,然后進(jìn)行有性生殖。因此,一種溞在整個(gè)生活史中會(huì)出現(xiàn)三種個(gè)體,即雄溞、孤雌生殖溞和有性生殖溞,它們對(duì)毒物的敏感性不同,試驗(yàn)時(shí)應(yīng)該用純一個(gè)體。孤雌生殖溞數(shù)量很多,一般試驗(yàn)均采用這種個(gè)體。另外,不同齡期的溞對(duì)毒物的敏感性不同,老年個(gè)體敏感性差,故不宜作為試驗(yàn)材料,試驗(yàn)通常采用出生后2~4d的幼溞。
(2)試驗(yàn)的培養(yǎng)和馴化 Banta(1921年)建議用馬糞(風(fēng)干)170g,菜園土2000g,加過(guò)濾池水10L,在室溫15~18℃下經(jīng)3~4d,用細(xì)篩過(guò)篩,再用過(guò)濾水稀釋2~4倍,便可使用。這種培養(yǎng)液為 Banta液,效果很好,至今仍被采用。
試驗(yàn)前把懷卵的孤雌生殖溞用吸管吸出,分開(kāi)飼養(yǎng),經(jīng)24h后,這批雌溞所產(chǎn)生的幼溞經(jīng)吸出或用塑料紗過(guò)濾分離后,再養(yǎng)2~4d就可用作試驗(yàn)溞。
(3)試驗(yàn)條件? 容器:溞類(lèi)培養(yǎng)可用水族箱、搪瓷桶、陶瓷缸、玻璃缸和燒杯等容器,培養(yǎng)最好在恒溫設(shè)備中進(jìn)行,并可適當(dāng)曝氣。
試驗(yàn)用水:池水、河水、井水均可作為試驗(yàn)水,但必須清潔,水中懸浮物應(yīng)當(dāng)濾除用水一般要經(jīng)活性炭過(guò)濾,必要時(shí)用紫外線消毒。用自來(lái)水時(shí)必須人工曝氣或靜置1~2d,去除余氯。試驗(yàn)水溫要求在20℃左右,pH=8~9,溶解氧不能低于4mg/L,氯度(Cl-)500~2000mg/L
(4)試驗(yàn)步驟? 枝角類(lèi)毒性試驗(yàn)分為預(yù)備試驗(yàn)和正式試驗(yàn)兩部分。
①預(yù)備試驗(yàn)。在做正式試驗(yàn)前,為了確定試驗(yàn)濃度范圍,必須進(jìn)行預(yù)備試驗(yàn)。預(yù)備試驗(yàn)的濃度范圍可廣些,每個(gè)濃度2~3個(gè)溞就可以。根據(jù)試驗(yàn)要求的時(shí)間(24或48h)找出大部分不死亡的濃度。一次找不準(zhǔn)確,可再做二次或多次,直至找到正式試驗(yàn)所用濃度范圍。
對(duì)于耗氧量大或變化快的試驗(yàn)物質(zhì),最好用流水裝置進(jìn)行試驗(yàn)。
②正式試驗(yàn)。選擇濃度的方法與魚(yú)類(lèi)試驗(yàn)相同。每個(gè)濃度要有2~3個(gè)平行試驗(yàn),另外設(shè)一對(duì)照。正式試驗(yàn)至少要重復(fù)兩次。試驗(yàn)毒物溶液配制時(shí),要先配成母液,再稀釋至所需濃度。
用作試驗(yàn)的溞,先移至表面皿,在體視顯微鏡或放大鏡下進(jìn)行檢查、過(guò)數(shù),然后再移入試驗(yàn)液。急性試驗(yàn)時(shí),用80mL小燒杯裝50mL試驗(yàn)水,每杯放10個(gè)溞。
通過(guò)溞類(lèi)毒性試驗(yàn)可以求得半致死濃度(LC50)或叫半忍受限(half tolerance limit,HTL),以反映污染物或有毒廢水對(duì)溞類(lèi)的毒性。半忍受限用在規(guī)定時(shí)間內(nèi)引起溞類(lèi)半數(shù)死亡的藥物濃度來(lái)表示,用直線內(nèi)插法求得(參考魚(yú)類(lèi)毒性試驗(yàn))。死亡標(biāo)準(zhǔn)掌握的尺度直接關(guān)系到所求的數(shù)值,一般用停止活動(dòng)(沉到水底不動(dòng))作為死亡的標(biāo)準(zhǔn)。
枝角類(lèi)急性試驗(yàn)一般為48h,也有用24h或96h的,急性毒性試驗(yàn)一般不喂食。
5.發(fā)光細(xì)菌毒性檢測(cè)
發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)法是以一種非致病的明亮發(fā)光桿菌作試驗(yàn)生物,以其發(fā)光強(qiáng)度的變化為指標(biāo),測(cè)定環(huán)境中有害有毒物質(zhì)的生物毒性的方法。
細(xì)菌的發(fā)光過(guò)程是菌體內(nèi)一種新陳代謝的生理過(guò)程,是呼吸鏈上的一個(gè)側(cè)支,即菌體是借助活體細(xì)胞內(nèi)的ATP、熒光素(FMN)和熒光素酶發(fā)光的,綜合化學(xué)反應(yīng)過(guò)程為:?
FMNH2+2RCHO2+O2?細(xì)菌熒光酶 FMN+2RCOOH+H2+hv
該光波長(zhǎng)在490nm左右,這種發(fā)光過(guò)程極易受到外界條件影響,凡是干擾或損害細(xì)菌呼吸或生理過(guò)程的任何因素都能使細(xì)菌發(fā)光強(qiáng)度發(fā)生變化。當(dāng)有毒物質(zhì)與發(fā)光菌接觸時(shí),可影響或干擾細(xì)菌的新陳代謝,從而使細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度下降或熄滅,這種發(fā)光強(qiáng)度的變化,可用精密測(cè)光儀定量測(cè)定。有毒物質(zhì)的種類(lèi)越多,濃度越大,抑制發(fā)光的能力也越強(qiáng),對(duì)于氣體中的可溶性有毒物質(zhì)可以通過(guò)把它吸收溶解到液體中,然后測(cè)試其對(duì)發(fā)光細(xì)菌的影響。在一定濃度范圍內(nèi),有毒物質(zhì)濃度與發(fā)光強(qiáng)度呈一定的線性關(guān)系,因此可利用發(fā)光細(xì)菌來(lái)監(jiān)測(cè)環(huán)境中的有毒污染物。
目前,國(guó)內(nèi)外采用的發(fā)光細(xì)菌實(shí)驗(yàn)有三種測(cè)定方法:①新鮮發(fā)光細(xì)菌培養(yǎng)測(cè)定法;②發(fā)光細(xì)菌和海藻混合測(cè)定法;③冷凍干燥發(fā)光菌粉制劑測(cè)定法。
