制麥及啤酒釀造過程中的真菌及真菌毒素問題
?引言
??? 啤酒中真菌毒素給公共衛生帶來的危險還不確定，而真菌毒素對寵物和家畜的危害已經得到證實。啤酒中真菌毒素主要來自制麥和啤酒釀造過程中污染的麥芽或輔料。
??? Scott在1996年討論了制麥和啤酒釀造過程中的真菌毒素問題，并公布了從不同國家進口到加拿大的啤酒樣品中真菌毒素含量的調查結果。Wolf-Hall及Schwarz于2002年發表了真菌和真菌毒素對啤酒質量及安全影響的綜述。Dupire?2003年、Melotte 2004年及Boivin 2005年重點對歐洲制麥和釀酒行業中的真菌毒素問題予以關注。南非的odhav在2005年也對這個課題進行了綜述，探討了控制啤酒中真菌毒素研究的物理、化學及生物學信息。其他人如Castro年對啤酒中的赭曲霉素A進行了綜述。本綜述將主要關注鐮刀霉真菌毒素。
????1、大麥中的真菌毒素
??? 大麥生長過程中受到植物鐮刀霉頭枯萎病也叫瘡癡病的嚴重影響。來自于美國中西部赤霉病感染的大麥中檢出單端孢霉烯，真菌毒素，包括脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON或致吐毒素黃熱毒)、雪腐鐮刀菌烯醇、T-2毒素、HT-2毒素、二醋酸麃草鐮刀菌烯醇(DAS)以及雌激素樣的真菌毒素，玉米烯酮。其中赤霉病感染的谷物中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)是檢出量最大的真菌毒素。在啤酒中檢出了痕量的(ppb)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、雪腐鐮刀菌烯醇、T-2毒素、HT-2毒素、二醋酸麃草鐮刀菌烯醇(DAS)、玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素、儲曲霉毒素A和伏馬菌素。同時在制麥及釀造過程的副產物中真菌毒素也倍受關注。
????2、制麥
??? 鐮刀霉在發芽過程中會繼續生長，并產生真菌毒素。浸漬時，由于溶解和排水有一定損失，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的濃度降低，使之接近或低于檢出限。而發芽5天后，真菌的生長導致脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的濃度增加18%～114 %。在發芽2～3天時可以觀察到麥角固醇的顯著增長(真菌生物量的分子標準)，然后就是脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的增長。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)在高達170℃的溫度下仍很穩定，烘干時(DON)幾乎沒有變化。Wolf-Hall及Bullerman1998年發現鐮刀霉在35℃下比在25℃下產生的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)及15-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)量多。
??? 在發芽過程中鐮刀霉的生長影響到其他品質特性，包括麥芽、啤酒噴涌及啤酒顏色和風味的改變。赤霉病感染的大麥發芽率降低可能是由于菌絲體侵入胚芽和/或有抑制發芽的真菌毒素存在。顏色的改變可能是由于感染的真菌產生色素或是由于真菌對大麥蛋白質的酶解活性使麥芽中可溶性氨基氮的量增加造成的。
????3、釀造
??? 使用赤霉病感染的大麥麥芽在釀造的麥汁成分上就有所變化(可溶性氮和碳水化合物)，真菌產生的蛋白酶高于大麥蛋白酶的水解能力，這將影響成品啤酒的顏色，風味，質地和泡沫特性。Haikara在1983年指出其對發酵度和啤酒聲都有增加的效果，這可能是由于酵母代謝的自由氨基氮增加并且單糖達到了更高的含量。酵母也可能受到真菌代謝物的影響，1981年Lafont等指出酵母在含有10～50μg/g T-2毒素的發酵液中發酵速率以58%～80%的速度增長。這說明可以用5～50μg/g的玉米烯酮，5～10μg/g的DAS及50μg/g的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)來表示生長率的影響，而μg/g的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON )則沒有任何影響。Boeira等在1999年發現雪腐鐮刀菌烯醇在低于50μg/g的濃度下對啤酒酵母菌株沒有任何影響。Boeira等在2000年研究了脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、玉米烯酮及伏馬菌素Bl的組合對酵母的交叉作用，他們發現脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON) 和玉米烯酮之間存在協同增效作用，但是僅在很高的濃度下。即使赤霉病感染的大麥用于釀酒，都不可能發現任何真菌毒素有這么高的濃度。
??? 研究表明酵母發酵期間脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)會增高。B?hm-Schraml等在1997年指出脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)在發酵的20h內增長，100h后開始降低。
??? 1989年從Whitehead及Flannigan發現通過增加接種密度能夠降低二醋酸麃草鐮刀菌烯醇對發酵的影響。他們提出某種酵母可以使真菌毒素解毒如T-2毒素，同時提出真菌毒素抗性酵母的發展將有巨大好處，因為盡管不能用于制啤酒麥芽或動物飼料，但真菌毒素重度污染的谷物仍然能夠更好的利用。有一些微生物能夠使單端孢霉烯解毒，這些微生物可以作為修飾乙醇產生菌的基因原材料。
??? 在釀造過程中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON )似乎很穩定，Niessen在1993年發現脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON )將繼續存在于成品酒中。這項研究說明在糊化過程中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的濃度增長40%，這也表明脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)可以在糊化過程中從蛋白質鰲合物中釋放出來。Wolf-Hall等在1999年發現從捻壓過的錐形谷粒的水萃取物中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的回收率在萃取過程中能夠改進26%，這可能是由于蛋白酶和淀粉酶的作用從感染的谷物中釋放出更多的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)。
??? Schwarz等在1995年用自然感染約1.8～17.2μg/g脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)和1.6～4.8μg/g玉米烯酮的大麥麥芽釀制啤酒。結果表明成品酒中殘存了脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的80%～93%，而在廢麥糟中僅存在痕量。在成品中沒有檢出玉米烯酮，在廢麥糟中回收到60%的玉米烯酮。現己提出玉米烯酮通過酵母代謝轉化成玉米赤霉烯醇，但是使用GC/MS檢測方法未檢測出任何玉米烯酮。
??? 除了啤酒中鐮刀霉真菌毒素的影響和存在，使用赤霉病感染的谷物還會影響其他的啤酒品質特性。開瓶時泡沫的噴涌與啤酒制造中使用赤霉病感染的谷物密切相關。啤酒噴涌是由啤酒中形成大量穩定的微泡造成的，這些微泡的晶核中心是谷物中真菌生長的產物，并且不僅是鐮刀霉能夠產生，其他諸如曲霉菌及青霉菌也能造成噴涌，而鐮刀霉可能是最大的問題來源。啤酒噴涌由Casey在1996年進行了綜述。Schwarz等在1997年提出鐮刀霉的噴涌因素是由于真菌所產生的水溶性成分，并且能夠用禾谷鐮刀霉生長的蛋白陳水溶液誘導啤酒的噴涌。可能用脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的存在和量可以預測啤酒噴涌的傾向，但還需要更多的研究。
????4、控制
??? 目前控制與赤霉病感染大麥相關問題的最有效方法就是避免它的發生。美國的制麥公司對購買的谷物規定0.5ppm脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)或更小的標準。而這不總是可行的。目前無法在農田中控制赤霉病。已經開發出多種利用受到感染的谷物的技術，一般歸屬于以下三個領域：分離出受到感染的麥粒；凈化或去除谷物中存在的毒素，預防或抑制真菌生長。
??? 小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)可以通過分離出重度污染赤霉病的麥粒而顯著降低，如翹曲缺陷麥粒，這些麥粒已經萎縮，變小，密度降低，可以用重選法除去。而大麥，如果感染發生在麥粒發育后期，麥粒的萎縮變小。篩選大麥也許不是降低脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)濃度的有效方法。大麥外殼似乎是真菌和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)濃度最高的地方，去殼破壞胚芽，降低發芽率，不是一個很實用的方法。
??? 處理結癡的谷粒減少脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的含量也是可用的。一些化學處理如亞硫酸鈉，氯氣，濕的臭氧和氨水都顯示出可以減小脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)的濃度。這些處理對于谷物質量都有嚴重影響，反應產物不穩定，不希望獲得的殘渣存在于谷物中。
??? 單端孢霉烯毒性可以在次氯酸鈉堿性溶液中迅速破壞。Trenholm等在1992年發現赤霉病感染的大麥在1M碳酸鈉中浸泡30min，再用蒸餾水漂洗30min 2次后脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)和玉米烯酮分別減少74%和81%。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)在堿性條件下不穩定。事實上麥芽制造的傳統方法是浸漬時使用石灰水，而這一步對發芽期間對鐮刀霉的生長和毒素的產生沒有任何影響。培養可以降低真菌毒素的基因修飾酵母，有的微生物能夠使某些單端孢霉烯解毒，這些微生物可以作為插人修飾乙醇生產菌的基因材料來源。
??? 防止或抑制真菌生長的方法包括物理法、化學法及生物技術。大麥的物理處理法如熱處理的研究報道很少，用巴氏法給谷物滅菌殺死真菌后仍然可以發芽，Kottapalli等在2003年使用熱水及放射處理以減少鐮刀霉感染，還能保證大麥的充分發芽。Kottapalli等在2006年進一步評估了輻射控制麥芽制造，發現了6～8kCy的劑量就能控制麥芽中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)，而對麥芽質量影響最小。
??? 有一些資料顯示化學法對大麥中的鐮刀霉影響很大，包括甲醛、次氯酸鹽及氯化汞。而這些，將不會為釀酒者們接受，他們不希望化學物質或者具有潛在害處的反應產物留在啤酒中。采用殺真菌劑可以預防初期的鐮刀霉感染，可是這種處理費用昂貴，同時殺真菌劑只在一個很短的時期內有用。消毒劑如次氯酸鈉能減少大麥種子中的鐮刀霉黃色鐮刀菌，去除谷物毒素。但需要高濃度的消毒劑，這些消毒劑會影響大麥中希望存在的競爭微生物。較高的消毒劑或副產物殘留對發酵過程中的酵母是有害的，并可影響成品酒的質量。一個較新的方法就是使用臭氧，可以快速分解為氧氣，可對大麥迅速消毒和解毒。臭氧可以去除黃曲霉毒素、環匹阿尼酸、赭曲霉素A、黑麥酮酸及玉米烯酮的毒性。Kottapalli等在2005年進行了對臭氧及過氧化氫對鐮刀霉和大麥發芽的影響實驗，得出這些處理是有效的化學控制方法。
??? 赤霉病抗性大麥植株的培育正在探索之中，但是仍需要許多時間才能實現這一目標。即使赤霉病抗性可以達到，這些新的培育植株也需要具有麥芽發芽的品質特性才行，目前沒有真正的抗性大麥植株存在。
??? 使用競爭性菌株的微生物學控制方法可參考，如白地霉添加在浸漬過程中培養，Boivin及Malanda在1997年說明浸漬大麥中鐮刀霉感染率從86%減少到0。鐵皮石斛在大麥中并不典型，但是在麥芽中可以普遍發現。用鐵皮石斛啟動培養也需要對毒素的產量進行監視，因為某些菌株能夠產生植物堿棒麥角素。
??? 乳酸菌具有產生抗真菌化合物的能力。Lowe及Arendt綜述了在制麥和釀造過程中乳酸菌的使用和影響。沃恩等在2005年描述了使用乳酸菌和修飾過的酵母保持麥芽和啤酒質量的一些新方法。盡管微生物學控制方法很有前途，啤酒釀造和制麥工業還是一直在尋找快捷、理想的物理方法實現“在線”操作。
??? 對于任何一種預防真菌生長的方法，都需要對受到影響的微生物做一些實驗來檢測是否殺傷了真菌，如鐮刀霉及真菌毒素的合成是否減少。化學藥品的亞致命濃度或抑制濃度可以預防真菌的生長，但又刺激了真菌毒素的產生。殺真菌劑的應用增加了真菌毒素，山梨酸也可以刺激黃曲霉毒素Bl和T-2的產生，輻射對黃曲霉及寄生曲霉影響的研究說明殘余的微生物具有增強產生黃曲霉毒素的能力，而這種情況在大麥中的鐮刀霉就沒有發現。
????5、結論
??? 感染的大麥在浸漬過程中，真菌毒素，如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)，可能會減少，鐮刀霉還能生長并且在浸漬、發芽和烘干時仍然會產生毒素。在麥芽發芽前谷物的脫毒可能并不實際，除非能防止真菌的進一步生長。輻射在麥芽發
芽時可以作為預防鐮刀霉生長的方式，可是殘余真菌產生真菌毒素的能力及對質量的影響就需要更進一步的研究。臭氧處理不會在啤酒中留下殘余的化學物質也是可以采用的，最希望采用的還是生物控制法，可是尚需對質量的影響進行評估。通過生物技術手段，在酵母中插人具有去除毒性的基因也是可能的，這就使得麥汁脫毒時真菌生長不再是個問題。各種不同技術的發展可以幫助改進產品的安全性，例如由赤霉病感染的谷物釀造的啤酒。
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