細(xì)菌的革蘭氏染色和特殊形態(tài)觀察
革蘭染色法是細(xì)菌學(xué)中最廣泛使用的一種鑒別染色法。1884 年 由丹麥醫(yī)師 Gram 創(chuàng)立。近年來由于對細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)有了較深入的了解，對革蘭染色的機(jī)制提出不同的看法。一般認(rèn)為革蘭陽性細(xì)菌的肽聚糖層較厚，經(jīng)乙醇處理后使之發(fā)生脫水作用而使孔徑縮小，結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物保留在細(xì)胞內(nèi)而不被脫色；而革蘭陰性細(xì)菌的肽聚糖層很薄，脂肪含量高，經(jīng)乙醇處理后部份細(xì)胞壁可能被溶解并改變其組織狀態(tài)，細(xì)胞壁孔徑大，不能阻止溶劑透入，因而將結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物洗去而被脫色。雖然如此，革蘭染色的差異并不能完全認(rèn)為是化學(xué)的差別，也因物理結(jié)構(gòu)不同結(jié)果不同，例如酵母菌細(xì)胞壁的成份完全和細(xì)菌不同，但具有革蘭染色陽性反應(yīng)。
方法是先將細(xì)菌用結(jié)晶紫染色，加媒染劑（增加染料和
細(xì)胞的親和力）后，用脫色劑（酒精或丙酮）脫色，再用復(fù)染劑染色。如果細(xì)菌
不被脫色而保存原染液顏色者為革蘭陽性菌(G＋)；如被脫色，而染上復(fù)染液的顏
色者為革蘭陰性菌(G-)。此染色法可將所有具有細(xì)胞壁的細(xì)菌分為兩大類：革蘭 陽性菌和革蘭陰性菌。
單染色法：只能觀察微生物的大小、形狀、和細(xì)胞排列狀況，但不能鑒別微生物以及它的特殊構(gòu)造等。
復(fù)染色法：用兩種或兩種以上染色液進(jìn)行染色，有協(xié)助鑒別微生物的作用，故也稱鑒別染色法。常用的有：革蘭氏染色法、抗酸染色法、芽孢染色法、鞭毛染色法等。
染色原理： 現(xiàn)在認(rèn)為細(xì)菌對革蘭染色的不同反應(yīng)主要是革蘭陽性菌和陰性菌 的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)與化學(xué)組成不同。革蘭陽性菌的細(xì)胞壁較厚，肽聚糖含量多，且交
聯(lián)度大，脂類含量少，經(jīng) 95％乙醇脫色時(shí)，肽聚糖層的孔徑變小，通透性降低，
與細(xì)胞結(jié)合的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物不易被脫掉，因此細(xì)胞仍保留初染時(shí)的顏色。 而革蘭陰性菌的細(xì)胞壁較薄，含有較多的類脂質(zhì)，而肽聚糖的含量較少，乙醇脫
色時(shí)溶解外層類脂質(zhì)，增加了細(xì)胞壁的通透性，使初染的結(jié)晶紫和碘的復(fù)合物易 于滲出，結(jié)果細(xì)胞被脫色，經(jīng)復(fù)染后，又染上復(fù)染的顏色。
實(shí)驗(yàn)試劑
革蘭氏染色液一套?
結(jié)晶紫
碘液
95%乙醇
番紅花紅
孔雀綠
實(shí)驗(yàn)設(shè)備
顯微鏡
蓋玻片
載玻片
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 革蘭氏染色
（1）涂片
（2）初染：在做好的涂面上滴加草酸銨結(jié)晶紫染液，染1分鐘，傾去染液，流水沖洗至無紫色。
（3）媒染：先用新配的路哥氏碘液沖去殘水，而后用其覆蓋涂面1分鐘，后水洗。
（4）脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進(jìn)行脫色約15－20秒，后立即用流水沖洗。
（5）復(fù)染：滴加番紅染色液，染3－5分鐘，水洗后用吸水紙吸干。
（6）鏡檢：觀察染色結(jié)果并繪圖。
2. 染色過程：涂片（大腸桿菌和金黃色葡萄球菌）→干燥→固定→初染（結(jié)晶 染色過程： 紫染色 1min）→媒染（碘 1min）→水洗→95%乙醇脫色（1min）→復(fù)染（番紅花 紅染色 1min）→干燥→鏡檢（油鏡）
3. 油鏡的使用與保養(yǎng)
（1）在需觀察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)油鏡，在轉(zhuǎn) 換油鏡時(shí)，從側(cè)面水平注視鏡頭與玻片的距離，使鏡頭浸入油中而 又不以壓破載玻片為宜。
（2）用雙眼觀察目鏡，并慢慢轉(zhuǎn)動(dòng)粗調(diào)節(jié)器至出現(xiàn)模糊物象，然后用細(xì) 調(diào)節(jié)器至物象清晰為止。
（3）如果不出現(xiàn)物象或者目標(biāo)不理想要重找。
（4）油鏡使用完畢，先用擦鏡紙沾少許乙醇將鏡頭上和標(biāo)本上的香柏油 擦去，然后再用干擦鏡紙擦干凈。
影響因素
操作因素
1、涂片太厚 在涂片時(shí)細(xì)菌挑的太多，沒法分開，在脫色時(shí)就不能將第一步染上的結(jié)晶紫的顏色脫去，可能會(huì)使革蘭陰性菌也出現(xiàn)紫色，誤認(rèn)為革蘭陽性菌。
2、脫色時(shí)間
陽性菌透性小，不易被脫色，陰性菌透性大，易脫色；但這是在固定的時(shí)間條件下的結(jié)果，如果延長脫色時(shí)間，也會(huì)使脫色劑滲透進(jìn)陽性菌的細(xì)胞壁中，使染上的結(jié)晶紫脫去顏色，最后染上復(fù)紅的顏色，變成革蘭陰性菌。而脫色時(shí)間太短的話又會(huì)使陰性菌染上的結(jié)晶紫不能完全脫色，出現(xiàn)紫色，誤認(rèn)為革蘭陽性菌。
3、固定方法
固定不僅能殺死細(xì)菌，改變細(xì)菌對染料的通透性，還能使細(xì)菌吸附在玻片上，保持原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)。固定方法是將干燥后的細(xì)菌涂片以中等速度通過火焰三次，以玻片觸及手背皮膚熱而不燙為宜。但在實(shí)際操作中有的同學(xué)將玻片在火焰上烤的太久，改變了細(xì)菌原有的通透性，會(huì)使細(xì)菌的染色性發(fā)生變化。影響了染色的結(jié)果。
細(xì)菌因素
1、細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間 細(xì)菌的典型形態(tài)、染色性是在對數(shù)生長期，取這時(shí)的細(xì)菌做革蘭染色可以反應(yīng)細(xì)菌的真實(shí)的染色性。如果細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間太長，變成了老齡菌，染色性就會(huì)發(fā)生變化，可能會(huì)使革蘭陽性菌染成革蘭陰性菌。
2、培養(yǎng)基的成分
一般認(rèn)為革蘭陽性菌體內(nèi)含有特殊的核蛋白質(zhì)鎂鹽與多糖的復(fù)合物，它與碘和結(jié)晶紫的復(fù)合物結(jié)合很牢，不易脫色。但是如果培養(yǎng)基中缺乏核蛋白質(zhì)鎂鹽就不能合成菌體成分的核蛋白質(zhì)鎂鹽，細(xì)菌與碘和結(jié)晶紫的復(fù)合物結(jié)合就不牢固，容易脫色，可能會(huì)使革蘭陽性菌染成革蘭陰性菌。
染液因素
1、碘液 碘液作為媒染劑能增加染料與被染物的親和力。如果碘液放置時(shí)間太長，或經(jīng)日光照射失效，失去媒染劑的作用，就可能使結(jié)晶紫與細(xì)菌結(jié)合的不牢固，容易被脫色，使革蘭陽性菌染成革蘭陰性菌。
2、結(jié)晶紫 結(jié)晶紫的濃度太高，就會(huì)使染上的顏色不容易被酒精脫色，可能會(huì)使革蘭陰性菌染成革蘭陽性菌。
3、酒精 酒精作為脫色劑，革蘭染色的脫色酒精濃度為95%
，在此濃度下革蘭陽性菌染上的結(jié)晶紫不易被脫去，保留紫色，革蘭陰性菌染上的結(jié)晶紫容易被脫去，最后呈紅色。但當(dāng)酒精的濃度為70%
時(shí)，它的脫色能力最強(qiáng)，可能使革蘭陽性菌染上的結(jié)晶紫也被脫去，使革蘭陽性菌染成革蘭陰性菌。
