2，4-二硝基苯肼比色法測定水溶性維生素
1、原理
總維生素C包括還原型、脫氫型和二酮古樂糖酸。用酸處理過的活性炭把還原型維生素C氧化為脫氫維生素C,再繼續氧化為二古樂糖酸,二古樂糖酸再與2,4-二硝基苯肼作用生成紅色脎,根據脎在硫酸溶液中的含量與維生素C含量成正比,進行比色定量。
2、儀器
①恒溫箱:37℃士0.5℃。
②可見-紫外分光光度計。
③碎機
3、試劑
①硫酸(4.5mol/L)? ? 小心地加250mL濃硫酸(相對密度1.84)于700mL水中,冷卻后用水稀釋至1000mL。
②85%硫酸? ? 小心地加900mL濃硫酸(相對密度1.84)于100mL水中。
③2,4-二硝基苯肼溶液(20g/L)? ? 溶解2g2,4-二硝基苯肼于100mL硫酸(4.5mol/L)中,過濾。不用時保存于冰箱中,每次用前必須過濾。
④草酸溶液(20g/L)? ??溶解20g草酸(H2C2O4)于700mL水中,稀釋至1000mL。
⑤草酸溶液(10g/L)? ? 取500mL草酸溶液(20g/L)稀釋至10mL。
⑥硫脲溶液(10g/L)? ??溶解5g硫脲于500mL草酸溶液(10g/L)中。
⑦硫脲溶液(20g/L)? ??溶解10g硫脲于500mL草酸溶液(10g/L)中。
⑧鹽酸(1mol/L)? ??取100mL鹽酸,加入水中,并稀釋至1200mL。
⑨維生素C標準溶液? ??稱取100mg純維生素C溶解于100mL草酸溶液(20g/L)中,此溶液每毫升相當于1mg維生素C。
⑩活性炭? ??將100g活性炭加到750mL鹽酸(lmol/L)中,回流1～2h,過濾,用水洗數次,至濾液中無鐵離子(Fe3+)為止,然后置于110℃烘箱中烘干。
檢驗鐵離子的方法:利用普魯士藍反應,將亞鐵氰化鉀(20g/L)與1%鹽酸等量混合,將上述洗出濾液滴入,如有鐵離子則產生藍色沉淀。
4、操作方法
1)試樣的制備
①鮮樣的制備? ? 稱取100g鮮樣及吸取100mL20g/L草酸溶液,倒人搗碎機中打成勻漿,取10～40g勻漿(含1～2mg維生素C)倒入100mL容量瓶中,用草酸溶液(10g/L)稀釋至刻度,混勻。
②干樣制備? ??稱1～4g干樣(含1～2mg維生素C)放入乳體內,加人草酸溶液(10g/L)磨成勻漿,倒入100mL容量瓶中用草酸溶液(10g/L)稀釋至刻度,混勻。
將上述試樣過濾,濾液備用。不易過濾的試樣可用離心機離心后,傾出上清液,過濾,備用。
2)氧化處理
取25mL上述濾液,加入2g活性炭,振搖1min,過濾,棄去最初數毫升濾液。取10mL此氧化提取液,加入10mL硫脲溶液(20g/L),混勻,此試樣為稀釋液。
3)顯色反應
①于三個試管中各加入4mL氧化處理的稀釋液,一個試管作為空白,在其余試管中加入1.0mL2,4-二硝基苯肼溶液(20g/L),將所有試管放入(37士0.5)℃恒溫箱或水浴中保溫3h。
②3h后取出,除空白管外,將所有試管放入冰水中。空白管取出后使其冷卻至室溫,然后加入1.0mL2,4-二硝基苯肼溶液(20g/L),在室溫中放置10～15min后放入冰水內。其余步驟同試樣。
4)85%硫酸處理
當試管放入冰水后,向每一試管中加入5mL85%硫酸,滴加時間至少需要1min,需邊加邊搖動試管。將試管自冰水中取出?在室溫下放置30min后比色。
5)比色
用1cm比色皿,以空白液調零點,于500nm波長測吸光值。
6)標準曲線的繪制
①加2g活性炭于50mL標準溶液中,振搖1mim,過濾。
②取10mL濾液放入500mL容量瓶中,加5.0g硫脲,用草酸溶液(10g/L)稀釋至刻度,維生素C濃度20g/mL。
③取5mL、10mL、20mL、25mL、40mL、50mL、60mL稀釋液,分別放入7個100mL容量瓶中,用硫脲溶液(10g/L)稀釋至刻度,使最后稀釋液中維生素C的濃度分別為1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、8μg/mL、10μg/mL、12μg/mL。
④按試樣測定步驟形成脎,并比色。
⑤以吸光值為縱坐標,維生素C濃度(μg/mL)為橫坐標,繪制標準曲線或求得回歸方程。
5、計算
式中? ? X——試樣中總維生素C的含量,mg/100g;
? ? ? ? ? ?c——由標準曲線查得或由回歸方程算得的試樣氧化液中總維生素C的濃度,?μg/mL;
? ? ? ? ? ?V——試樣用10g/L草酸溶液定容的體積,mL;
? ? ? ? ? ?F——試樣氧化處理過程中的稀釋倍數;
? ? ? ? ? ?m——試樣的質量,g。
? ? ? ?計算結果表示到小數點后兩位。
6、說明及注意事項
①本方法為GB/T5009.86-2003標準第二法,第一法為熒光法。此外還有2,6-二氯靛酚滴定法、高效液相色譜法等。
②全部實驗過程應避光進行操作。
③加入85%硫酸后試管從冰水中取出,溶液的顏色會繼續變深,所以必須計算好,加入硫酸后準時0.5h比色。
④硫脲可防止維生素C被氧化,且可幫助脎的形成,最終溶液中硫脲的濃度均需一致,否則影響色度。
