細胞凋亡、細胞壞死和細胞焦亡如何鑒別？
細胞凋亡的檢測方法有很多，下面給大家介紹常用的形態學檢測方法。
光學顯微鏡和倒置顯微鏡
凋亡細胞的主要特征為核染色質致密深染，形成致密質塊，有時可碎裂。在HE染色的組織切片中細胞體積縮小，胞質致密、嗜酸性染色增強，并可形成凋亡小體。在組織中凋亡細胞常以分散單個形式存在，凋亡細胞與周圍細胞分離，不引起炎癥反應。
本方法簡便易行，但在細胞密集的組織中對于改變不典型的細胞判斷較困難，常缺乏較為特征的指標，具有較強的主觀性，重復性差。本方法可用于調亡現象的初步觀察，作為分析指標之一。
未染色細胞：凋亡細胞的體積變小、變形，全面皺縮，細胞膜完整但出現發泡現象，細胞凋亡晚期可見凋亡小體，凋亡小體為數個圓形小體圍繞在細胞周圍。貼壁細胞出現皺縮、變圓、脫落。
染色細胞：姬姆薩（Giemsa）染色、瑞氏染色等。正常細胞核色澤均一；凋亡細胞染色質濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態；壞死細胞染色淺或沒染上顏色。
蘇木素-伊紅（HE）染色：細胞核固縮碎裂、呈藍黑色、胞漿呈淡紅色（凋亡細胞），正常細胞核呈均勻淡藍色或藍色，壞死細胞核呈很淡的藍色或藍色消失。
熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡
一般以細胞核染色質的形態學改變為指標來評判細胞凋亡的進展情況。常用的DNA特異性染料有：Hoechst 33342， Hoechst 33258，DAPI。三種染料與DNA 的結合是非嵌入式的，主要結合在DNA的A-T堿基區。紫外光激發時發射明亮的藍色熒光。
Hoechst是與DNA特異結合的活性染料，能進入正常細胞膜而對細胞沒有太大細胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡細胞中的熒光強度要比正常細胞中要高。DAPI為半通透性，用于常規固定細胞的染色。
PI和Hoechst33342雙標：PI、Hoechst33342均可與細胞核DNA（或RNA）結合。但PI不能通過正常細胞膜，Hoechst則為膜通透性熒光染料，故細胞在處于壞死或晚期調亡時細胞膜被破壞，這時可為PI著紅色。
正常細胞和中早期調亡細胞均可被Hoechst著色，但是正常細胞核的Hoechst著色的形態呈圓形，淡蘭色，內有較深的蘭色顆粒；而調亡細胞的核由于濃集而呈亮蘭色，或核呈分葉，碎片狀，邊集。故PI著色為壞死細胞；亮蘭色，或核呈分葉狀，邊集的Hoechst著色的為調亡細胞。
凋亡細胞體積變小，細胞質濃縮。細胞凋亡過程中細胞核染色質的形態學改變分為三期：Ⅰ期的細胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質出現濃縮狀態；Ⅱa期細胞核的染色質高度凝聚、邊緣化；Ⅱb期的細胞核裂解為碎塊，產生凋亡小體。
電子顯微鏡
雖然光學顯微鏡下可以看見胞膜起泡現象和凋亡小體,但凋亡細胞的形態學變化大多發生在超微結構,因此用光鏡觀察難以令人滿意,而透射電鏡可清楚地觀察到細胞結構在凋亡不同時期的變化。電鏡形態學觀察是迄今為止判斷凋亡最經典、最可靠的方法,被認為是確定細胞凋亡的金標準。
檢測方法：透射電鏡標本經戊二醛和餓酸雙重固定，丙酮脫水，環氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸電子又重染色，透射電鏡觀察。掃描電鏡標本經戊二醛和餓酸雙重固定，乙醇逐級脫水，CO2臨界點干燥，真空噴金，掃描電鏡觀察。
結果評判: 可見凋亡細胞表面微絨毛消失，核染色質固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質緊實，細胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細胞吞噬現象。
缺點：
1）只能定性,不能定量;
2）標本處理過程復雜,設備相對昂貴,對檢查者的技術水平要求較高,不適于大批標本檢測;
3）在組織切片上進行電鏡觀察時,有時凋亡很難與正常細胞有絲分裂相鑒別,因為兩種情況下都可出現染色質濃聚。如同時進行熒光染色,可彌補電鏡檢查的不足。
流式細胞技術
流式細胞儀檢測凋亡細胞是通過檢查其光射特征及熒光參數時行的。細胞穿過流式細胞儀的激光束集點時使激光發生散射，分析散射光可以提供細胞大小及結構的信息。由于光散射牧場生并非凋亡細胞的特異性指標，細胞的機械性損傷和細胞壞死也可以使前向散射光減弱。因此，只有將光散射特性的檢測與熒光參數的檢測結合起來才能準確地辨認凋亡細胞。
細胞凋亡過程中核酸內切酶在DNA分子核小體間的降解，導致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，細胞熒光染色后作流式細胞儀分析，可以發現在DNA直方圖上正常二倍體細胞的Go/G1峰前出現一個亞二倍體峰（xub-G1峰，即AP峰--apoptotic peak）,代表凋亡細胞。
如何鑒別細胞焦亡？
細胞焦亡的機制中GSDMD的切割，IL-1β和IL-18前體的切割成熟和釋放是關鍵信號，因此證明所誘發的細胞死亡方式是否為細胞焦亡，需要幾個關鍵的實驗證據：
①GSDMD的切割（Western檢測）；
②Caspase的激活，主要是Caspase-1，Caspase-4，Caspase-5，Caspase-11（Western檢測）；
③IL-1β和IL-18前體的切割成熟和釋放（Western，ELISA等）；
④細胞形態學檢測（CCK-8等）；
⑤染色質完整性檢測（Tunel等）。
完整檢測方式如下：
1、形態變化
①掃描電鏡觀察細胞形態；
②免疫熒光染色（GSDMD/GSDME）；
③Tunel檢測。
2、檢測焦亡相關基因及蛋白
①q-PCR/Western Blot方法檢測焦亡相關基因或蛋白的表達水平（例如，Caspase-1、4、5、11；GSDMD；Cleaved Caspase-3、IL-1β、IL-18、NLRP3、ASC等）；
②ELISA試劑盒檢測炎癥因子的水平；
③CCK8法測定細胞活力；
④免疫組化檢測組織蛋白的表達。
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