分享至
清潔驗證：微生物總有機碳回收率和線性
簡介
在生產消費品時，有效地清潔生產設備對質量控制來說至關重要。清潔工藝的目標是降低產品污染的風險，有效的清潔工藝可以將風險降低到可接受的水平，以確保產品質量。如果無法衡量和驗證清潔工藝的有效性，就無法了解產品質量和消費者安全的風險。
根據美國食品和藥品管理局（FDA）提供的數據，2017年食品和飲料行業產品召回的主要原因是微生物對產品的污染。對于減少和消除微生物污染來說，強有力的清潔工藝至關重要，因此監控清潔工藝有效性的方法同樣至關重要。
總有機碳（TOC）分析是消費品生產商廣泛采用的非專屬方法，用于檢測產品、清潔劑、以及微生物等污染物的殘留量。
為了證明TOC分析法適用于預期用途，我們對設備清潔之后可能尚存的殘留物進行了回收和線性研究。工廠通常會測試化學污染物和化合物，但很少用TOC分析法來測試微生物的回收率。本文旨在探討對于清潔驗證和確認，TOC分析法能否證明可接受的微生物污染回收率和線性。
實驗設計和設置
我們同科羅拉多大學博爾德分校合作，用一整夜時間在胰酶大豆肉湯中培養100毫升枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。以4500轉/分鐘的速度將最終培養物的十毫升等分試樣離心分離10分鐘，形成細胞沉淀。
在每次離心之間，倒出上面的液體，用渦旋混合方法用10毫升超純水使沉淀細胞重新懸浮。重復此過程7次。設計淋洗循環以除去細胞培養基帶來的TOC污染。在第7次淋洗循環后，根據已有的4,6-二氨基-2-苯基吲哚（4,6-diaminidino-2-phenylindole，DAPI）染色任務來對細胞進行重新懸浮、稀釋、計數（見圖1）。
圖 1：枯草芽孢桿菌在細胞計數的熒光顯微鏡成像
確定細胞密度之后，用Sievers??M9 TOC分析儀測量1 ppm確認標樣組，然后進行三次細胞濃度稀釋。在測量TOC之后，用0.45 μm滅菌過濾器過濾剩余樣品，徹底除去細菌（見圖2）。然后再次測量TOC以確定每個樣品的非細胞背景TOC（見圖2）。
?圖2：枯草芽孢桿菌的過濾過程
結果
表 1：微生物細胞密度與TOC的相關性結果
圖 3：微生物細胞密度與TOC的線性關系
表1和圖3是微生物TOC相關性研究的結果。線性趨勢線的R2值為0.9981，表明實測細胞密度有良好的線性趨勢。根據圖3所示的線性擬合趨勢線方程，定義為3倍噪聲的檢測水平（LOD，Level of Detection）為2.74E+06細胞/mL。此外，根據線性擬合趨勢線和M9儀器規格，50 ppm的最大儀器定量限為2.49E+08細胞/mL。
在進行微生物TOC定量之后，分別將1毫升的每種細胞密度溶液放在不銹鋼試樣板上進行試樣污染，然后使試樣干燥。此試樣污染的目的是確定微生TOC相關結果的目視檢測限。圖4是微生物試樣污染圖。
圖 4：微生物試樣板污染
(A) 5.8E+07
細胞/mL
(B) 5.8E+06
細胞/mL
(C) 5.8E+05
細胞/mL
討論與結論
微生物TOC相關結果和試樣污染圖都說明了連續監測已有的清潔工藝有效性的重要性。在理想光線下，很容易在試樣板上看到最高細胞密度（5.8E+07細胞/mL）的污染斑。而對于較低細胞密度，即使光線很好，也很難在試樣板上看到污染斑。這表明除了強有力的清潔工藝之外，還需要用非目測的方法來測試清潔工藝的有效性。
根據收集的數據，可以想象用于生產消費品的設備上仍有顯著微生物污染，卻僅憑目視檢查就被投放到生產中，導致嚴重后果。因此必須連續監測已有的清潔工藝的有效性，才能降低產品質量風險和消費者安全風險。
最后，由于微生物分子組成的不確定性，很難確定微生物溶液的回收率。本研究根據先前在確定活性微生物細胞中的碳含量時的發現，旨在確定微生物溶液的理論回收率。圖5是理論微生物TOC產出量的計算過程?；诿總€細胞的碳原子參考數，5.8E+07細胞/mL的理論TOC濃度為11.6 ppm。
圖 5：理論微生物 TOC 產出量的維度分析
在本文的實驗中，測量到5.8E+07細胞/mL的TO實際回收值為9.13 ppm，對挑戰性的化合物的回收率為78.7%，從而證明實驗方法是成功的。
總之，本研究用Sievers M9 TOC分析儀演示了在清潔驗證和確認時的細胞密度同目視檢測限的關系，成功地證實了微生物TOC回收率。實驗數據支持使用Sievers TOC分析儀來確認設備清潔度，同時表明除了目視檢查之外還須考慮使用監測微生物污染的定量方法。TOC分析法是測量殘留物、監測清潔工藝、降低總體風險的有效方法。Sievers分析儀為您提供能解決您一切清潔驗證和確認需求的TOC解決方案、服務、支持。
參考文獻
1. Recall Index and Spotlight. Expert Solutions?https://www.stericycleexpertsolutions.com/recall-index/
2. DAPI Protocol For Fluorescence Imaging Thermo-Fisher Scientific?– US?https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/protocols/dapi-imaging-protocol.html
3. Phillips, Rob, and Ron Milo. “A Feeling for the Numbers in?Biology.” Proceedings of the National Academy of Sciences 106,?no. 51 (December 22, 2009): 21465.?https://doi.org/10.1073/pnas.0907732106.
◆?◆?◆
聯系我們，了解更多！
400?887 8280
sievers.china@veolia.com
cn.sieversinstruments.com
