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尾氣分析質(zhì)譜在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用
磁質(zhì)譜儀在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用
磁質(zhì)譜和四級(jí)桿這兩種類型的質(zhì)譜儀已用于監(jiān)測(cè)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程。
HaiYuan Goh等于2019年發(fā)表相關(guān)文章介紹了他們的相關(guān)研究。在5L和50L規(guī)模反應(yīng)器進(jìn)行Fed-batch培養(yǎng)過(guò)程中，使用磁質(zhì)譜儀 (Thermo Scientific, Prima BT Mass Spectrometer)?進(jìn)行相關(guān)氣體分析。整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程通過(guò)切換進(jìn)氣中壓縮空氣、純氧以及氮?dú)饨M分控制溶解氧維持在30%±1%。在這種模式下，作者發(fā)現(xiàn)活細(xì)胞濃度（VCC）與進(jìn)入反應(yīng)器的進(jìn)氣氧氣濃度之間的相關(guān)系數(shù)R2?0.9; 因此，進(jìn)氣O2組分可以表征VCC。通過(guò)計(jì)算的OUR和溶解氧數(shù)據(jù)，可以對(duì)體積氧傳質(zhì)系數(shù)（kLa）進(jìn)行定量，在整個(gè)培養(yǎng)期間，發(fā)現(xiàn)在不同的時(shí)間點(diǎn)添加消泡劑均會(huì)降低kLa；實(shí)時(shí)計(jì)算的整個(gè)生物反應(yīng)器運(yùn)行期間的特定耗氧率（qO2）為2-20 pmol /細(xì)胞/天，也與之前文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞氧消耗速率范圍一致。同時(shí)，該文章第一次報(bào)道了呼吸商（RQ）和細(xì)胞培養(yǎng)代謝狀態(tài)之間的相關(guān)性：在乳酸產(chǎn)生階段平均RQ> 1，和乳酸消耗階段平均RQ<1。
Thermo Scientific? Prima 質(zhì)譜儀系列中的扇形磁場(chǎng)分析器由層壓材料組成，可快速、穩(wěn)定地分析無(wú)數(shù)用戶自定義氣體。如果質(zhì)譜儀要監(jiān)視多個(gè)生物反應(yīng)器，可以在多流路之間進(jìn)行快速切換。Thermo Fisher Scientific 開(kāi)發(fā)了獨(dú)特的快速多流路進(jìn)樣器（RMS），可快速選擇多達(dá) 64 個(gè)流路的樣品。
美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）在生物醫(yī)藥生產(chǎn)領(lǐng)域發(fā)起Quality by design (QbD)，?要求通過(guò)采用過(guò)程分析技術(shù)（PAT），多變量數(shù)據(jù)分析（MVDA）等技術(shù)高效確定最佳工藝條件，以減少時(shí)間成本。因此，細(xì)胞培養(yǎng)工藝需要更多的在線分析。應(yīng)該注意的是氣體大致上包括進(jìn)出生物反應(yīng)器的任何氣體，而不僅限于氧氣和二氧化碳。傳統(tǒng)上二氧化鋯傳感器用于氧氣濃度測(cè)定，紅外傳感器用于二氧化碳濃度的測(cè)定。與質(zhì)譜（MS）相比，這些技術(shù)對(duì)氣體的檢測(cè)范圍有限，靈敏度較低。雖然質(zhì)譜操作更為復(fù)雜，但可以一臺(tái)設(shè)備檢測(cè)和定量除了氧氣和二氧化碳的多種氣態(tài)化合物。以前在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中已成功使用MS進(jìn)行氣體分析。哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程進(jìn)氣速率，尤其是在小型反應(yīng)器上進(jìn)氣速率通常遠(yuǎn)低于微生物發(fā)酵，有時(shí)接近質(zhì)譜儀樣品入口的最低要求（10mL/min）。
這可能需要更長(zhǎng)的樣本流切換時(shí)間，幸運(yùn)的是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)非常長(zhǎng)的批處理時(shí)間和更低的呼吸速率往往不需要很高的頻率分析。在這項(xiàng)研究中，數(shù)據(jù)來(lái)自每個(gè)樣本流每分鐘一次的頻率是令人滿意的。
在哺乳動(dòng)物細(xì)胞發(fā)酵中，進(jìn)氣成分是經(jīng)常變化的混合物（例如，氮?dú)猓鯕夂投趸迹６趸嫉暮繌慕咏愕?00％，這就要求氣體分析質(zhì)譜儀具有非常寬的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)范圍，并且在如此寬的范圍內(nèi)都穩(wěn)定呈線性。由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的低呼吸率，與入口氣體進(jìn)行比較，出口氣體中的氧氣、二氧化碳濃度，產(chǎn)生的差異小得多，這要求氣體分析光譜儀必須具備短期精度很高的測(cè)量，可以觀察到這些很小差異, 從而得到有用的氧氣吸收率（OUR），二氧化碳釋放速率（CER）和呼吸商（RQ）。由于使用碳酸氫鹽作為pH值緩沖，加上二氧化碳易溶于水，因此測(cè)定二氧化碳的變化很難。應(yīng)用質(zhì)譜法可以更有效地進(jìn)行氣體分析, 用質(zhì)量平衡原理，側(cè)重于二氧化碳的和氧氣（細(xì)胞呼吸成分）的檢測(cè)，并將其與氣體利用聯(lián)系起來(lái)。
應(yīng)用圖釋：
△圖片來(lái)源：HaiYuan Goh et al，Applications of of gas mass spectrometry in fed batch mammalian cell culture,Bioprocess and Biosystems Engineering. doi:10.1007/s00449-019-02242-2
MS檢測(cè)原始?xì)怏w數(shù)據(jù)得出以下參數(shù)：
氧氣吸收率（OUR），kLa（對(duì)于O2），比耗氧率（qO2），二氧化碳釋放速率（CER），比二氧化碳產(chǎn)量率（qCO2）和呼吸商（RQ）。
Fbioreactorin是進(jìn)入生物反應(yīng)器的氣體流量，單位為mL/min；Fbioreactor out從生物反應(yīng)器中流出的氣體流量,單位為mL/min；FMS，in氣體流入MS分析儀的流量，單位為mL/min；Vbioreactor生物反應(yīng)器中培養(yǎng)體積；[O2*]進(jìn)氣中的氧氣濃度以μmolL-1為單位；[O2]反應(yīng)器中的氧氣濃度以μmolL-1為單位；VCC，細(xì)胞活力，cell/mL；OxC和CDC是從與MS相關(guān)聯(lián)的GasWorks軟件獲得的派生參數(shù)信息。這些信息是使用如下公式?（7–14）得出的?：
結(jié)果和討論
圖3
從樣本中進(jìn)行例行采樣（用于離線分析），5 L和50 L反應(yīng)器的采樣量分別為20 mL和30 mL。相比培養(yǎng)體積，取樣體積對(duì)于尾氣分析的影響可以忽略。消泡劑和補(bǔ)料的添加都會(huì)引起輸入氧氣的激增，CO2?和?N2成比例降低。這個(gè)現(xiàn)象也說(shuō)明消泡劑的加入會(huì)降低體積氧傳遞系數(shù)。
有趣的是，還檢測(cè)到了在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中兩個(gè)事件。首先，在5 L規(guī)模的生物反應(yīng)器中，MS檢測(cè)到濾器堵塞。MS軟件在夜晚接收檢測(cè)信號(hào)，沒(méi)有操作員在場(chǎng)。經(jīng)早上檢查MS記錄數(shù)據(jù)，確定濾器堵塞。在無(wú)菌條件下更換過(guò)濾器后培養(yǎng)照常進(jìn)行。這樣的故障沒(méi)有來(lái)自MS的實(shí)時(shí)氣體數(shù)據(jù)就不會(huì)發(fā)現(xiàn)。第二，在50L培養(yǎng)過(guò)程中,??在某些情況下，生物反應(yīng)器壓縮空氣供應(yīng)失效，氣體質(zhì)譜儀檢測(cè)到氣體組成成分的變化。當(dāng)壓縮空氣供應(yīng)減少，50 L 反應(yīng)器控制系統(tǒng)能夠切換到不同的氣體混合物以保證DO。也就是將由純氧而不是通常的壓縮空氣輔以氧。而這時(shí)DO的讀數(shù)沒(méi)有變化。這意味著此種情況下，使用氣體MS分析儀將有助于對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程的有效追蹤。針對(duì)5 L和50 L反應(yīng)器的整個(gè)培養(yǎng)周期，計(jì)算了OUR 、kLa和qO2。5和50 L生物反應(yīng)器運(yùn)行合并數(shù)據(jù)圖4所示，顯示在不同的規(guī)模上不同參數(shù)的趨勢(shì)。
圖4
圖4、從重復(fù)運(yùn)行5 L STR和單個(gè)50 L SUB運(yùn)行得出的氧氣相關(guān)參數(shù)。A. OUR值; B. 在添加消泡劑后的kLa值;?
在5 L和50 L反應(yīng)器上，O2-in數(shù)據(jù)如圖4a所示，表明O2-in與VCC峰相關(guān)，如圖3d所示。因?yàn)镺2-in隨著氧氣消耗量（或OUR）的增加而增加，當(dāng)存在更多細(xì)胞時(shí)，氧氣消耗量會(huì)繼續(xù)增加，反之亦然。5 L和50 L的運(yùn)行的VCC與O2-in之間的相關(guān)性全都約為0.9（圖5a）。根據(jù)VCC-OUR數(shù)據(jù)， 50升反應(yīng)器的r2值為0.710， 5 L的r2值為0.440和0.338。這可能是由于生物反應(yīng)器的體積的不準(zhǔn)確和VCC測(cè)量缺乏足夠數(shù)據(jù)點(diǎn)，另外從5 L系統(tǒng)生成的數(shù)據(jù)OUR的干擾較大。這也表明O2-in將成為細(xì)胞培養(yǎng)中VCC變化的更可靠的在線指標(biāo)，可能是工藝控制中更好的參數(shù)。
圖5
圖5來(lái)自兩個(gè)5 L罐和50 L SUB的VCC和氣體數(shù)據(jù)的相關(guān)性。A. VCC與O2-in; B. VCC與OUR氧氣利用率。
kLa可以從生物反應(yīng)器進(jìn)口和出口的已知?dú)怏w流量、氧氣濃度計(jì)算。kLa數(shù)據(jù)表明5 L生物反應(yīng)器（?14 h-1）中的初始kLa高于50 L生物反應(yīng)器（?7.5 h-1）。尾氣分析能夠捕捉到消泡劑導(dǎo)致kLa降低。消泡劑導(dǎo)致kLa下降在5 L運(yùn)行中也可以觀察到，盡管兩次重復(fù)之間不一致（圖4b）。另外，隨著反應(yīng)器的變化，kLa變化沒(méi)有很大差異，即使在50升反應(yīng)器增加了一個(gè)攪拌槳。
不同生物反應(yīng)器的qO2趨勢(shì)是一致的（圖4c）。對(duì)于培養(yǎng)的前半部分，維持相對(duì)恒定的qO2，而在培養(yǎng)的后半部分觀察到qO2相對(duì)較高。一種解釋這種變化的假設(shè)是代謝從乳酸生產(chǎn)轉(zhuǎn)向消耗。在乳酸迅速積累的時(shí)期，糖酵解是細(xì)胞的主要途徑，需要相對(duì)較低氧氣量。向乳酸消耗的轉(zhuǎn)變可能標(biāo)志氧化磷酸化，需要氧氣作為最終的電子供體。因此，在乳酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧兿男袨闀r(shí)，qO2變得相對(duì)較高。這分別在50 L運(yùn)行第7天和5 L運(yùn)行第9天之后觀察到（圖4c）。這幾天里也發(fā)生一致相應(yīng)的乳酸代謝變化（圖3h）。有趣的是，從第10天開(kāi)始以后，在5 L培養(yǎng)中qO2的值是50 L的約3倍，即使50 L細(xì)胞密度平均更高。它暗示也許5 L系統(tǒng)中有一個(gè)不同于50 L系統(tǒng)的的生理環(huán)境，導(dǎo)致更高的qO2。
圖6
圖6、呼吸商圖形分布，在兩次5 L和一次50 L SUB運(yùn)行期間，由尾氣計(jì)算，乳酸產(chǎn)生階段和乳酸消耗階段，以黃色和綠色突出顯示。A. 50 L 的RQ; B. 5L的 RQ。
應(yīng)注意的是，在沒(méi)有二氧化碳進(jìn)到生物反應(yīng)器中的時(shí)期，在尾氣中檢測(cè)到CO2（圖3e–g）。尾氣中最高二氧化碳的比例為?2％mol。系統(tǒng)產(chǎn)生的二氧化碳可能是由于來(lái)自細(xì)胞呼吸釋放的二氧化碳。CER和qCO2僅在此特定時(shí)期內(nèi)計(jì)算，因?yàn)橛行╇A段沒(méi)有外部二氧化碳進(jìn)入到生物反應(yīng)器中。qCO2似乎在兩個(gè)不同規(guī)模的3個(gè)不同反應(yīng)器中具有一致性，?5 pmol / cell / day。這些數(shù)據(jù)和Goudar等人報(bào)道一致。
RQ與細(xì)胞培養(yǎng)代謝狀態(tài)之間的關(guān)系。RQ可以用作細(xì)胞培養(yǎng)代謝狀態(tài)的變化指標(biāo)。來(lái)自MS的氣體數(shù)據(jù)能夠提供實(shí)時(shí)RQ數(shù)據(jù)（圖6）。顯然， 如前所述，由于添加補(bǔ)料和消泡劑的結(jié)果引起的氣體峰值，在圖4b中，也影響了RQ。重復(fù)的兩次5 L反應(yīng)器的RQ峰（圖6b）并非完全相同。這可能標(biāo)志在將氣體輸送到每一個(gè)5 L生物反應(yīng)器中的方式上存在實(shí)際的物理差異。主要可能是氣流量，進(jìn)入生物反應(yīng)器和進(jìn)入MS改變的氣體需求引起波動(dòng)。另外，兩個(gè)反應(yīng)器都由串聯(lián)的相同氣源供給，所以進(jìn)氣流量變化的影響可以根據(jù)每個(gè)反應(yīng)器所要求的氣體而變化。這些數(shù)據(jù)干擾項(xiàng)在50升系統(tǒng)中的問(wèn)題較少，使RQ圖形更易解釋。乳酸的代謝（生產(chǎn)或消耗）狀態(tài)和每個(gè)代謝過(guò)程中的近似平均RQ值之間顯示了相關(guān)性。50 L反應(yīng)器比5 L更加明顯。如果忽略補(bǔ)料和消泡劑添加對(duì)RQ的影響，平均RQ值在乳酸生產(chǎn)階段為> 1，而乳酸消耗階段為<1（圖6a）。單純利用碳源（如葡萄糖）的 RQ值為1，同時(shí)氧化更多還原性分子（如氨基酸）和脂肪酸會(huì)導(dǎo)致RQ <1，因?yàn)樾枰嗟难鯕鈦?lái)完全氧化這些分子。在乳酸生產(chǎn)階段，糖酵解是主要的代謝途徑，高的比葡萄糖消耗率（數(shù)據(jù)未顯示）和相對(duì)較低的qO2，因此RQ更高。另一方面，在乳酸消耗階段，TCA活性較高涉及的氧化磷酸化導(dǎo)致更低葡萄糖消耗率（數(shù)據(jù)未顯示）及相對(duì)較高的qO2，最終導(dǎo)致較低的RQ。以前在搖瓶和深孔板實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證明，這種在高和低的糖酵解與產(chǎn)生乳酸和消耗乳酸之間的相關(guān)性。對(duì)200多個(gè)具有產(chǎn)生乳酸/消耗乳酸的生物反應(yīng)器數(shù)據(jù)的多元分析表明，相對(duì)于其他任何參數(shù)，乳酸的產(chǎn)生到消耗轉(zhuǎn)變更多與糖酵解能量流降低有關(guān)。
氣體分析的潛在應(yīng)用
尾氣MS分析儀有潛在的多種應(yīng)用，可能包括：
1. 磁質(zhì)譜可以檢測(cè)非典型氣體成分像硫化氫（H2S，低至ppm范圍），并用作細(xì)胞代謝壓力或產(chǎn)品質(zhì)量屬性的指標(biāo)。
2. 盡早發(fā)現(xiàn)基于氣體分析的微生物污染，可以最大程度地減少批次終止的決策時(shí)間。
3. 預(yù)定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)評(píng)估批次之間的差異，有利于在不同生產(chǎn)地點(diǎn)和生物反應(yīng)器平臺(tái)進(jìn)行技術(shù)轉(zhuǎn)移。
結(jié)論
綜上所述，使用磁質(zhì)譜進(jìn)行氣體分析成功在5 L和50 L進(jìn)行分批補(bǔ)料的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)。實(shí)時(shí)進(jìn)氣中氧氣百分比mol分壓與不同細(xì)胞培養(yǎng)階段的相關(guān)性很好，尤其是VCC。觀察到培養(yǎng)物中的乳酸和尾氣二氧化碳分壓之間負(fù)相關(guān)的關(guān)系。在整個(gè)培養(yǎng)持續(xù)周期內(nèi)，僅從尾氣數(shù)據(jù)中可以計(jì)算kLa 。此外，可以從氣體分析中可以發(fā)現(xiàn)影響kLa的特定動(dòng)作，例如消泡劑的添加。最后，觀察到的RQ 足以顯示培養(yǎng)期間乳酸的生產(chǎn)/消耗階段的相關(guān)性。預(yù)計(jì)這些技術(shù)仍然適用于工業(yè)GS-CHO細(xì)胞系。
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