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Science | 華大智造測序平臺助力解析植入后胚胎發育過程
2019年11月，由昆明理工大學靈長類轉化醫學研究院主導，深圳華大生命科學研究院等單位合作完成的最新研究成果“Dissecting primate early post-implantation development using long-term in vitro embryo culture”在國際著名學術期刊《科學》（Science）上在線發表。
文章利用單細胞測序技術解析了靈長類胚胎著床后特別是原腸運動時期重要的分子與細胞生物學事件，這對研究發育、衰老、人類疾病等領域有重大的推動作用。其中，華大智造DNBSEQ 平臺技術為研究提供了高質量的工具支撐。關于其原理優勢，此前已有文章表明DNBSEQ? 在針對單細胞的SNP calling等方面具有明顯優勢。
單細胞測序技術的發展日新月異，催生了諸多領域突破，華大智造近期發布的 “可以裝進口袋的單細胞實驗室”——DNBelab C系列產品也為單細胞文庫制備提供了便攜式、即時化、一站式的工具支撐。搭配華大智造測序平臺及單細胞分析軟件，就可以完成單細胞組學研究全流程。
研究摘要
靈長類胚胎早期著床后發育是哺乳動物發育的里程碑事件，然而這一階段也是胚胎發育研究中最不清晰的時期之一。本研究成功實現了食蟹猴胚胎體外20天培養，并通過對受精后9到20天的體外培養胚胎進行觀察，發現體外培養胚胎呈現出與體內發育胚胎高度一致的形態學與基因表達特征。
本文利用單細胞測序技術對體外培養7個時間點的胚胎細胞進行測序，發現與體內發育胚胎細胞高度類似的分化與基因表達軌跡。該研究第一次利用體外系統，解析了靈長類胚胎著床后特別是原腸運動時期重要的分子與細胞生物學事件。研究結果有助于加深人們對早期著床后胚胎發育的理解，對于細胞替代性治療及器官再生研究也具有指導意義。
研究方法
靈長類動物受精卵發育第7-20天變化
（備注：EPI:外胚層PE: 原始內胚層TE: 滋養層AMEC: 羊膜上皮細胞PGC: 原始生殖細胞 EXMC：胚外間充質細胞GAS：原腸胚細胞）
部分結果展示
本研究對食蟹猴胚胎體外培養系統進行了優化，使其能夠在體外培養20天，通過下圖1可以觀察到20天內細胞團（ICM）細胞不斷增殖形成盤狀結構。
圖1 食蟹猴胚胎體外培養系統（A:第7-20天觀察的胚胎形狀；B:胚胎盤長度；C: 第15天和第17天體外培養胚胎的絨毛樣本結構，箭頭表示絨毛狀結構）
通過免疫組化的方法分析體外培養的胚胎在不同時期蛋白表達相關情況，培養胚胎呈現出了與體內發育胚胎高度一致的形態學與基因表達特征（圖2、圖3）。第14天開始，在羊膜中出現T+/SOX17+/TFAP2C+細胞（圖2），這些都與體內發育胚胎表達情況一致（圖3），揭示了羊膜上皮是潛在的原始生殖細胞起源地。
圖2免疫熒光染色結果（體外培養胚胎第13、14、16、17天，箭頭表示羊膜內的原始生殖樣細胞；短箭頭表示外胚層下方的原始生殖樣細胞）
圖3原始生殖細胞mark gene表達情況
單細胞轉錄組和染色質可及性分析
本文利用單細胞測序技術對體外培養7個時間點的胚胎細胞進行測序（第9、11、13、15、17、19和20天），通過t-SNE降維分析, 下圖A鑒定出四組細胞（分布來自外胚層(EPI)、原始內胚層(PE，VE/YE)、滋養外胚層(TE)和胚外間充質(EXMC)，這些細胞與體內鑒定的細胞類型相同。
下圖C、D是滋養外胚層(TE)分化軌跡：從第11天開始TE細胞逐步分化，隨著CDX2表達的減少，TE細胞被分為兩種類型，表達高水平TCEAL4的細胞可能是滋養層細胞（CTS），表達高水平GCM1的細胞可能是合胞滋養層細胞（STS）。這個結果證實了小鼠中公認的滋養層干細胞標志物CDX2在靈長類早期胚胎發育中表達并不能維持。
下圖E是原始內胚層(PE，VE/YE)細胞的發育軌跡，可分化為兩個細胞簇。細胞簇1和細胞簇2分別表達高水平的apoa2和cxcr4。
下圖F其中細胞簇1表達與脂代謝、轉運的基因，而細胞簇2主要表達介導轉錄和蛋白質合成的基因。
下圖G是外胚層EPI細胞簇的分化軌跡，EPI-A和EPI-B與體內早期EPI細胞簇在一起，EPI-C與體內晚期EPI簇在一起，Gast與體內原腸胚細胞簇在一起。
討論
靈長類動物早期胚胎發育與人高度相似，但對于靈長類動物著床后胚胎發育的研究依然難以開展，人力物力花費巨大。
為了深入探索靈長類胚胎著床后發育過程中的分子機制，本研究實現了食蟹猴胚胎體外20天的培養，培養胚胎呈現出了與體內發育胚胎高度一致的形態學與基因表達特征，但是體外培養胚胎的結構最終在20天左右崩潰，需要進一步改進培養參數以實現更長時間的體外胚胎發育。
體外培養的食蟹猴胚胎細胞進行單細胞組學分析滋養外胚層、多能外胚層、原始內胚層轉錄組譜，發現外胚層（epiblast）細胞在分化中的細胞亞型與狀態變化，并揭示了氧化磷酸化途徑在na?ve多能性維持中的作用；證實了體外分化的原始生殖細胞樣細胞與體內原始生殖細胞在轉錄組水平的高度類似性。通過對細胞配體和受體基因表達的分析，揭示了外胚層、多能外胚層、原始內胚層譜系細胞間的互相作用關系，例如FGF和WNT通路在譜系分化中的重要作用。
體外培養胚胎開辟了一個嶄新的研究平臺，有助于深入了解靈長類動物早期發育過程中的動態分子和細胞變化，同時結合細胞追蹤技術和單細胞測序技術，將有助于確定細胞發育分化的規律和途徑。該研究工作首次利用體外系統，揭示了植入后早期非人類靈長類動物胚胎發生的關鍵發展事件和復雜的分子機制，有助于對人類早期著床后胚胎發育的理解。
