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淺談 | 激光共聚焦顯微鏡特點及應用

寧波永新光學股份有限公司

2022.8.09

激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）是基于共軛焦點技術設計的顯微鏡類型，即為使激光光源、被測樣品和探測器都處于彼此的共軛位置上。

基本原理

在一般的顯微鏡中通過將物鏡的焦平面與探測器重合使得觀測的像平面與相鄰的軸平面隔離開來，而在共聚焦顯微鏡中通過使用衍射受限的光點照亮樣品，并在該光點共軛焦點處的收集光路徑中使用針孔來過濾雜散光達到產生這種隔離效果從而提高分辨率。

激光共聚焦顯微鏡原理圖

成像特點

—

不同的焦平面上生成“z疊層”圖像

—

上圖所示結構中，只有在共軛的樣品層反射回的光可以通過收集光路徑中的小孔，其余無關的樣品層反射被小孔阻隔。這可以得到顯著的分辨率的提升。如下圖所示的是同一厚樣品的多維熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡的并排比較。當在不同的焦平面上拍攝一系列圖像時，可以生成通常被稱為“z疊層”的圖像，這一圖像顯示了共聚焦顯微鏡提供的分辨率和對比度增益以及這些增益的根本原因。可以看到在成像平面位于組織上方的堆棧頂部檢查圖像可以發現熒光圖像中帶有大量的散射光，而共聚焦顯微鏡的圖像則顯示為黑色。這種軸向上的PSF的減少直接導致了z疊層中間光學界面上觀察到的分辨率差異。

同一厚樣品

多維熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡成像比較

成像特點

—光學切片掃描成像—

激光掃描共聚焦顯微鏡的另一個特點是它是一種掃描成像技術，傳統的寬場照明技術是將整個樣品都照亮，因此可以圖像可以直接被肉眼或探測器捕捉，但是LSCM采用一束或多束聚焦光束穿過樣品掃描成像，這樣得到的圖像被稱為光學切片，下所示即為傳統的寬場照明方式與激光掃描共聚焦照明方式的區別。

傳統寬場顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡

照明方式區別

因此現代共聚焦顯微鏡的一種實際的工作方式如下圖所示，激光發出的激發光通過二向色鏡，通過一對振鏡在樣品x方向和y方向進行掃描，樣品激發（或反射）的光通過針孔進入PMT檢測器被記錄，記錄下的掃描圖像通過計算機重構出實際的樣品圖像。

一種實際的激光掃描共聚焦顯微鏡示意圖

成像特點

—分辨率對比寬場照明大幅提升—

在熒光顯微鏡中，單點發射的光強度由點擴散函數（PSF）描述，其圖案就是一個艾里斑，熒光系統的分辨率可以由艾里斑的半徑來描述，艾里斑的半徑可以由物鏡的數值孔徑和激發光的波長決定：

另一種熒光系統分辨率測量方式是半高寬最大值，即強度下降到峰值50%的值，此時寬場熒光照明的橫向分辨率為：

激光掃描共聚焦顯微鏡的分辨率為：

這表明，共聚焦顯微鏡的理論最大分辨率比寬場照明提高了

倍。下圖表示了寬場顯微鏡與共聚焦顯微鏡的對比，左圖為寬場顯微鏡得到的圖像，右圖為共聚焦顯微鏡得到的圖像。

寬場顯微鏡與共聚焦顯微鏡成像對比

主要應用領域

—醫療領域—

Li 等人通過LSCM技術對31位虹膜粘連但角膜透明的病人進行了檢查，觀察到類樹干狀結構、樹枝/灌木狀結構、果實特征結構、上皮狀結構等一些可能的結構變異，同時發現顏料粒子的減少可能會導致廷德爾積極現象[1]。

主要應用領域

—生物學領域—

L. Cortes等人通過將抗鈣結合蛋白（Alexa-568）和抗膠質纖維酸性蛋白（Alexa-488）對小鼠的小腦進行標記得到的圖像。并且通過快速獲取小鼠大腦的室管膜組織塊上熒光標記的運動纖毛的概覽，記錄下了運動纖毛的確切位置，揭示了運動纖毛的作用機制。

小鼠大腦圖像

小鼠大腦運動纖毛圖像

德國馬克斯·普朗克生物物理化學研究所的A. Politi、J. Jakobi以及P. Lenart等人通過Hoechst 44432對海拉細胞的DNA染色，使用微管蛋白抗體Alexa 488對微管染色以及鬼筆環肽Abberior STAR Red對F-肌動蛋白染色，使用LSCM得到了高效、超高分辨率的大視察視野的海拉細胞圖像，幫助更好的了解了海拉細胞的結構以及發展變化。

Dr. Gerry Apodaca等人通過用iDISCO對透明化的小鼠膀胱進行成像，獲得了清晰且完整的小鼠膀胱圖，有助于揭示小鼠膀胱內部運動的機理。

小鼠膀胱

主要應用領域

—高分子化學領域—

Deng等通過兩種Ｎ－硫代羧基內酸酐（MeSPG-NTA和Sar-NTA）的順序分段投料聚合合成兩親性嵌段共聚物。通過納米沉淀法、雙乳液法等自組裝方法，PMeSPG-b-PSar能分別形成納米和微米尺度的聚類肽囊泡。在LSCM的表征下，由雙乳液法獲得的微米囊泡在 H2O2刺激下隨時間逐漸崩解的過程被完整記錄下來。將一種疏水的光敏劑四苯基卟啉（TPP）引入到 PMeSPG-b-PSar囊泡體系中，TPP可通過疏水相互作用附著在囊泡膜上，在光刺激下會引起囊泡崩解[2]。

主要應用領域

—表面粗糙度領域—

Ibá?ez等人通過LSCM對收割不同谷物在鐮刀上產生的光澤進行測量，并測試了八種不同的加工材料（骨頭、鹿角、木材、新鮮皮、干皮、野生谷物、馴化谷物和蘆葦）產生的光澤，并通過分析軟件建立預測模型數據庫，首次證明了基于LSCM對使用磨損光澤的定量分析可以有效地識別用于加工不同接觸材料的工具[3]。